NMR studies of tandem WW domains of Nedd4 in complex with a PY motif-containing region of the epithelial sodium channel

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Abstract

Nedd4 (neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4) is a ubiquitin-protein ligase containing multiple WW domains. We have previously demonstrated the association between the WW domains of Nedd4 and PPxY (PY) motifs of the epithelial sodium channel (ENaC). In this paper, we report the assignment of backbone 1Hα, 1HN, 15N, 13C', 13Cα, and aliphatic 13C resonances of a fragment of rat Nedd4 (rNedd4) containing the two C-terminal WW domains, WW(II+III), complexed to a PY motif-containing peptide derived from the β subunit of rat ENaC, the βP2 peptide. The secondary structures of these two WW domains, determined from chemical shifts of 13Cα and 13Cβ resonances, are virtually identical to those of the WW domains of the Yes-associated protein YAP65 and the peptidyl-prolyl isomerase Pin1. Triple resonance experiments that detect the 1Hα chemical shift were necessary to complete the chemical shift assignment, owing to the large number of proline residues in this fragment of rNedd4. A new experiment, which correlates sequential residues via their 15N nuclei and also detects 1Hα chemical shifts, is introduced and its utility for the chemical shift assignment of sequential proline residues is discussed. Data collected on the WW(II+III)-βP2 complex indicate that these WW domains have different affinities for the βP2 peptide.

La protéine Nedd4 (précurseur neuronal 4 exprimé dans les cellules et réprimé au cours du développement) est une ubiquitine-protéine ligase ayant plusieurs domaines WW. Antérieurement, nous avons démontré une association entre les domaines WW de Nedd4 et les motifs PPxY (PY) du canal sodique épithélial (ENaC). Dans cet article, nous décrivons l'attribution des résonances des 1Hα, 1HN, 15N, 13C', 13Cα et 13C aliphatiques du squelette d'un fragment de la protéine Nedd4 de rat (rNedd4) ayant les deux domaines WW C-terminaux, WW (II+III), formant un complexe avec un peptide à motif PY dérivé de la sous-unité β du ENaC de rat, le peptide βP2. Les structures secondaires des deux domaines WW, déterminées à partir des déplacements chimiques des résonances de 13Cα et 13Cβ, sont pratiquement identiques à celles des domaines WW de la protéine YAP65 associée à Yes et de la peptidyl-prolyl isomérase Pin1. À cause du grand nombre de résidus proline dans ce fragment de la rNedd4, des expériences de triple résonance détectant le déplacement chimique de 1Hα ont été nécessaires pour compléter l'attribution des déplacements chimiques. Une nouvelle expérience de corrélation de résidus séquentiels grâce à leurs noyaux 15N et qui détecte également les déplacements chimiques de 1Hα, est présentée et son utilité pour l'attribution des déplacements chimiques d'une séquence de résidus proline est discutée. Les données obtenues concernant le complexe WW(II+III)-βP2 indiquent que ces domaines WW ont des affinités différentes envers le peptide βP2. [Traduit par la Rédaction]

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