NMR spectroscopic and enzymatic studies of DNA hairpins containing mismatches in the EcoRI recognition site

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Abstract

We have correlated the structural perturbations caused by DNA mismatches with the enzymatic data of the interaction of the restriction endonuclease EcoRI with DNA. Oligonucleotides d(CGAGAATTCTCA5GAXAATTCT) (X = G, A, T) and d(CGCGAATTYGCGT4CGCXAATTCGCG) (Y = C, X = G, T and Y = A, X = T) containing single mismatches within the EcoRI recognition site were characterized by NMR spectroscopy and by their EcoRI substrate properties. UV melting and gel electrophoresis studies confirm that the oligonucleotides form hairpin structures. The presence of either a CT or a CA mismatch results in markedly lower Tm and van't Hoff enthalpies compared with the fully base paired control. NMR imino proton spectra of these hairpins demonstrate that the perturbation caused by the two mispairs or a noncanonical AT pair is localized and limited to one or two base pairs on either side of the perturbation. The DNA hairpin structures containing single mismatches, and to a lesser extent also sequences with a single noncanonical base pair, are substrates for the restriction endonuclease. In addition to the strand scission at the nonperturbed GpA phosphodiester bond some cleavage is observed at the mismatched position. The interactions of the CA and CT mismatched hairpin with the enzyme are characterized by binding constants that are only 33 and 57 times lower, respectively, than that for the canonical sequence, corresponding to 8-10 kJ·mol-1 less favorable free binding energy. This, taken together with the NMR data, indicates that the CA and CT mismatches have only small effects on the EcoRI recognition of the DNA substrate. We conclude that two out of the three hydrogen bonds that characterize the interaction of EcoRI with the CG base pair in the canonical sequence can still be formed for either the CT or CA mismatched recognition site.

Nous avons établi une corrélation entre les changements structuraux causés par de mauvais appariements de l'ADN et les résultats des analyses enzymatiques de l'interaction entre l'endonucléase de restriction EcoRI et l'ADN. Les oligonucléotides d(CGAGAATTCTCA5GAXAATTCT) (X = G, A, T) et d(CGCGAATTYGCGT4CGCXAATTCGCG) (Y = C, X = G, T et Y = A, X = T) comportant un seul mauvais appariement dans le site de reconnaissance EcoRI ont été caractérisés à l'aide de la spectroscopie de RMN et de leurs caractéristiques de substrat de EcoRI. Les études d'électrophorèse en gel et les études de fusion à l'aide de l'absorption dans l'ultraviolet confirment que les oligonucléotides forment des structures en épingle à cheveux. La présence d'un mauvais appariement CT ou CA entraîne une Tm et des enthalpies de van't Hoff nettement inférieures à celles de l'oligonucléotide contrôle parfaitement apparié. Les spectres de RMN-1H des imines de ces structures en épingle à cheveux démontrent que le changement structural causé par les deux mauvais appariements ou par une paire AT atypique est localisé et limité à un ou deux paires de bases d'un côté ou de l'autre de la modification. Les structures en épingle à cheveux de l'ADN comportant un seul mauvais appariement et aussi, à un moindre degré, les séquences ayant une seule paire de bases atypique, sont des substrats de l'endonucléase de restriction. En plus du clivage du brin à la liaison phosphodiester GpA non modifiée, une hydrolyse est également notée à l'endroit du mauvais appariement. L'interaction de l'enzyme avec les structures en épingle à cheveux comportant un mauvais appariement CA ou CT est caractérisée par une constante de liaison 33 et 57 fois inférieure, respectivement, à celle de la séquence parfaitement appariée, ce qui correspond à une énergie libre moins favorable à la liaison de 8-10 kJ·mol-1. Couplé aux données de RMN, cela indique que les mauvais appariements CA et CT ont seulement des effets mineurs sur la reconnaissance du substrat d'ADN par EcoRI. Nous concluons que deux des trois liaisons hydrogène caractérisant l'interaction entre EcoRI et la paire de bases CG dans la séquence parfaitement appariée peuvent encore se former au site de reconnaissance ayant un mauvais appariement CA ou CT. [Traduit par la Rédaction]

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