An NH2-terminal deleted plasma membrane H+-ATPase is a dominant negative mutant and is sequestered in endoplasmic reticulum derived structures

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Abstract

The NH2-terminus of the plasma membrane H+-ATPase is one of the least conserved segments of this protein among fungi. We constructed and expressed a mutant H+-ATPase from Saccharomyces cerevisiae deleted at an internal peptide within the cytoplasmic NH2-terminus (D44-F116). When the enzyme was subjected to limited trypsinolysis it was digested more rapidly than wild type H+-ATPase. Membrane fractionation experiments and immunofluorescence microscopy, using antibodies against H+-ATPase showed that the mutant ATPase is retained in the endoplasmic reticulum. The pattern observed in the immunofluorescence microscopy resembled structures similar to Russell bodies (modifications of the endoplasmic reticulum membranes) recently described in yeast. When the wild type H+-ATPase was co-expressed with the mutant, wild type H+-ATPase was also retained in the endoplasmic reticulum. Co-expression of both ATPases in a wild type yeast strain was lethal, demonstrating that this is a dominant negative mutant.

La partie N-terminale de la H+-ATPase de la membrane plasmique est un des segments les moins bien conservés de la protéine chez les champignons. Nous avons construit et exprimé une H+-ATPase mutante de Saccharomyces cerevisiae ayant une délétion d'un peptide interne (D44-F116) dans la partie N-terminale cytoplasmique. La trypsine hydrolyse plus rapidement l'enzyme mutante que la H+-ATPase de type sauvage. Le fractionnement des membranes et la microscopie à fluorescence avec des anticorps dirigés contre la H+-ATPase montrent que la H+-ATPase mutante est retenue dans le réticulum endoplasmique. La structure observée en microscopie à fluorescence ressemble aux structures semblables aux corps de Russell récemment décrites chez la levure et qui sont des modifications des membranes du réticulum endoplasmique. La H+-ATPase de type sauvage est également retenue dans le réticulum endoplasmique lorsqu'elle est exprimée en même temps que l'enzyme mutante. La co-expression des deux ATPases dans une souche de levure de type sauvage est létale, ce qui démontre que c'est une ATPase mutante négative dominante.

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