Cloning of clustered Streptomyces viridosporus T7A lignocellulose catabolism genes encoding peroxidase and endoglucanase and their extracellular expression in Pichia pastoris

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Abstract

A 4.1-kb fragment of chromosomal DNA from the lignocellulose-decomposing actinomycete Streptomyces viridosporus T7A was previously found to encode a lignin peroxidase gene. However, when cloned into Escherichia coli in pBSKS+, peroxidase activity was not expressed. When cloned in pIJ702 in Streptomyces lividans, the gene was expressed in a peroxidase positive background, owing to the production by S. lividans of its own extracellular peroxidases. To circumvent these problems, the DNA was cloned into the commercial expression vector pIC9 for extracellular expression in the yeast Pichia pastoris. Yeast transformants, however, expressed two activities, extracellular peroxidase and an extracellular endoglucanase. The enzymes were not expressed by the yeast cells alone or by yeast cells with pIC9 without the insert. Expression of the enzymes by only those transformants expressing the 4.1-kb DNA was confirmed by Western blot analyses, by nondenaturing activity gel staining, and by spectrophotometric enzyme assays of extracellular culture filtrates. Activity gel staining showed that the two activities resided in different proteins and the peroxidase expressed was similar to ALip-P3, one of the isoenzymes of lignin peroxidase of the S. viridosporus T7A wildtype. Other evidence indicated that in the transformants, the peroxidase and endoglucanase genes in the 4.1-kb insert were controlled by the methanol-inducible AOX1 yeast promoter in pIC9, since their expression was induced by methanol. In the best transformants, extracellular production of peroxidase by recombinant P. pastoris cultures was significantly higher than typically observed in S. viridosporus. The results also indicate that lignocellulose catabolism genes may be clustered on the S. viridosporus chromosome.

On sait déjà que chez Streptomyces viridosporus T7A, un actinomycète capable de décomposer la lignocellulose, un fragment d'ADN chromosomique de 4,1 kb est responsable du gène de la lignine peroxydase. Par contre, après clonage chez Escherichiacoli dans pBSKS+, l'activité peroxydase n'est pas exprimée. Lorsque cloné dans pIJ702 de Streptomyces lividans, le gène s'exprimait dans un background d'activité peroxydase à cause de la propre production de peroxydases extracellulaires par le S. lividans. Pour contourner ces problèmes, l'ADN a été cloné dans le vecteur d'expression commercial pIC9 pour qu'il soit exprimé de façon extracellulaire chez la levure Pichia pastoris. Les transformants de la levure exprimaient cependant deux activités: une peroxydase extracellulaire et une endoglucanase extracellulaire. Les enzymes n'étaient pas exprimées par les levures d'origine ou par les levures possédant pIC9 sans fragment d'insertion. Le fait que seuls les transformants exprimant l'ADN 4,1-kb pouvaient exprimer les enzymes a été confirmé par buvardage de Western, par coloration en gel non-dénaturants et par des essais d'activité enzymatiques en spectrophotométrie sur des filtrats de culture. La coloration de gels mesurant l'activité a montré que les deux activités étaient reliées à différentes protéines et que la peroxydase exprimée était semblable à ALip-P3, une des isoenzymes de la lignine peroxydase du S. viridosporus T7A de type sauvage. Il semble aussi évident que, chez les transformants, les gènes de la peroxydase et de l'endoglucanase dans le fragment d'insertion de 4,1 kb, étaient contrôlés par le promoteur de levure A0X1 inductible par le méthanol dans pIC9 puisque leur expression était induite par le méthanol. Chez les meilleurs transformants, la production extracellulaire de peroxydase par P. pastoris recombinante est significativement plus élevée que celle typiquement observée chez S. viridosporus. Les résultats suggèrent que les gènes responsables du catabolisme de la lignocellulose pourraient être regroupés sur le chromosome.

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