Genetic and biochemical characterization of an exopolygalacturonase and a pectate lyase from Yersinia enterocolitica

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Abstract

Yersinia enterocolitica, an invasive foodborne human pathogen, degrades polypectate by producing two depolymerizing enzymes, pectate lyase (PL) and polygalacturonase (PG). The gene encoding the PG activity, designated pehY, was located in a 3-kb genomic fragment of Y. enterocolitica ATCC 49397. The complete nucleotide sequence of this 3-kb fragment was determined and an open reading frame consisting of 1803 bp was predicted to encode a PG protein with an estimated Mr of 66 kDa and pI of 6.3. The amino acid sequence of prePG showed 59 and 43% identity to that of the exopolygalacturonase (exoPG) of Erwinia chrysanthemi and Ralstonia solanacearum, respectively. The Y. enterocolitica PG overproduced in Escherichia coli was purified to near homogeneity using perfusion cation exchange chromatography. Analysis of the PG depolymerization products by high performance anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) revealed the exolytic nature of this enzyme. The Y. enterocolitica PL overproduced in E. coli was also partially purified and the Mr and pI were estimated to be 55 kDa and 5.2, respectively. HPAEC-PAD analysis of the PL depolymerization products indicated the endolytic nature of this enzyme. Southern hybridization analyses revealed that pehY and pel genes of Y. enterocolitica are possibly encoded in the chromosome rather than in the plasmid. Purified exopolygalacturonase (over 10 activity units) was unable to macerate plant tissues.

Yersinia enterocolitica, un pathogène invasif de l'homme transmis par les aliments, dégrade le polypectate en produisant deux enzymes de dépolymérisation, soit la pectate lyase (PL) et la polygalacturonase (PG). Le gène responsable de l'activité PG, désigné pehY, a été localisé sur un fragment génomique de 3-kb chez Y. enterocolitica ATCC 49397. La séquence nucléotidique complète de ce fragment de 3-kb a été déterminée et il est prévisible qu'un cadre de lecture ouvert comprenant 1803 pb code une protéine PG dont le Mr est estimé à 66 kDa et le pI à 6.3. La séquence des acides aminés de préPG a révélé 59% d'identité avec l'exopolygalacturonase (exoPG) d'Erwinia chrysanthemi et 43% avec celle de Ralstonia solanacearum. La PG de Y. enterocolitica, surproduite dans E. coli, a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente par chromatographie échangeuse de cations en perfusion. L'analyse des produits de dépolymérisation PG par chromatographie échangeuse d'anions à haute performance et la détection ampérométrique pulsée (HPAEC-PAD) a confirmé la nature exolytique de cette enzyme. La PL de Y.enterocolitica, surproduite dans E. coli, a aussi été partiellement purifiée et le Mr et le PI étaient respectivement de 55 Kda et 5.2. L'analyse HPAEC-PAD des produits de dépolymérisation PL a confirmé la nature endolytique de cette enzyme. L'hybridation Southern a montré que les gènes pel et pehY de Y. enterocolitica étaient possiblement localisés sur le chromosome plutôt que sur le plasmide. L'exoPG purifiée (plus de 10 unités d'activité) était incapable de causer la macération des tissus végétaux. [Traduit par la Rédaction]

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