Development of AFLP-derived, functionally specific markers for environmental persistence studies of fungal strains

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Abstract

The ability to rapidly identify and quantify a microbial strain in a complex environmental sample has widespread applications in ecology, epidemiology, and industry. In this study, we describe a rapid method to obtain functionally specific genetic markers that can be used in conjunction with standard or real-time polymerase chain reaction (PCR) to determine the abundance of target fungal strains in selected environmental samples. The method involves sequencing of randomly cloned AFLP (amplified fragment length polymorphism) products from the target organism and the design of PCR primers internal to the AFLP fragments. The strain-specific markers were used to determine the fate of three industrially relevant fungi, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and Chaetomium globosum, during a 4 month soil microcosm experiment. The persistence of each of the three fungal strains inoculated separately into intact soil microcosms was determined by PCR analyses of DNA directly extracted from soil. Presence and absence data based on standard PCR and quantification of the target DNA by real-time PCR showed that all three strains declined after inoculation (∼14-, 32-, and 4-fold for A. niger, A. oryzae, and C. globosum, respectively) but remained detectable at the end of the experiment, suggesting that these strains would survive for extended periods if released into nature.

La capacité d'identifier et de quantifier rapidement une souche microbienne dans un échantillon environnemental complexe peut mener à des applications variées en écologie, épidémiologie et dans l'industrie. Dans cette étude, nous décrivons une méthode rapide pour l'obtention de marqueurs génétiques fonctionnellement spécifiques qui peuvent être utilisés en combinaison avec le réaction en chaîne polymérase (PCR) commun ou en temps réel afin de déterminer l'abondance de souches de champignons ciblées dans des échantillons environnementaux donnés. La méthode inclut le séquençage de produits d'AFLP (polymorphisme de longueur de fragments amplifiés) issus de l'organisme ciblé et clonés au hasard de même que l'élaboration d'amorces de PCR internes aux fragments d'AFLP. Les marqueurs spécifiques à la souche ont été utilisés pour déterminer le sort de trois champignons d'importance industrielle, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae et Chaetomium globosum, à la suite d'une expérience de quatre mois en microcosme de sol. La persistance de chacune des souches de champignons inoculées séparément dans des microcosmes de sol intact fut déterminée par analyse de PCR des ADN extraits directement du sol. Les données de la présence et absence basée sur le PCR commun et la quantification de l'ADN cible par PCR en temps réel a démontré que les trois souches ont décliné après inoculation (∼14, 32 et 4 fois pour A. niger, A. oryzae et C. globosum, respectivement) mais sont demeurées détectables à la fin de l'expérience, indiquant que ces souches survivraient à des périodes prolongées après avoir été libérées dans la nature.

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