Temporal expression of Mycobacterium smegmatis respiratory terminal oxidases

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Abstract

Terminal oxidases provide the final step in aerobic respiration by reducing oxygen. The mycobacteria possess two terminal oxidases: a cytochrome c aa3 type and a quinol bd type. We previously isolated a bd-type oxidase knockout mutant of Mycobacteriumsmegmatis that allowed for functional analysis of the aa3 type without the contribution of bd-type activity. Growth of M. smegmatis LR222 and JAM1 (LR222bd::kan) was monitored and the cytochrome content at different time points examined. No difference in aerobic growth was observed between M. smegmatis LR222 and JAM1. Membranes were obtained from these cultures and the oxidase concentrations were calculated from their spectrum. Although the mutant was producing only one oxidase type, this oxidase did not reach wild-type levels of expression, suggesting an additional mechanism for energizing the membrane. Moreover, the concentration of both oxidases in the wild-type strain dropped when cultures entered stationary phase, which was not the case for the aa3-type oxidase of the mutant strain. This oxidase remained at a constant concentration post mid-log phase. RNase protection assays also demonstrated late growth phase dependent message expression of the bd oxidase and that the subunits I and II genes were cotranscribed as an operon.

Les oxydases terminales effectuent la dernière étape de la respiration aérobique en réduisant l’oxygène. Les mycobactéries possèdent deux oxydases terminales: une cytochrome c oxydase de type aa3 et une oxydase de type quinol bd. Nous avons déjà isolé un mutant inactivé de l’oxydase de type bd chez Mycobacteriumsmegmatis qui a permis d’effectuer des analyses fonctionnelles du type aa3en absence d’activité attribuable au type bd. La croissance de M. smegmatis LR222 et JAM1 (LR222bd::kan) a été suivie et le contenu en cytochrome a été mesuré en fonction du temps. Aucune différence de la croissance aérobique n’a été observée entre M. smegmatisLR222 et JAM1. Les membranes ont été isolées de ces cultures et les concentrations d’oxydase ont été calculées. Même si le mutant ne produisait qu’un type d’oxydase, cette oxydase n’atteignait pas les niveaux mesurés chez les souches sauvages, suggérant la présence d’un mécanisme supplémentaire pour fournir l’énergie à la membrane. De plus, la concentration des deux oxydases de la souche sauvage a chuté lorsque les cultures ont été maintenues en phase stationnaire, ce qui n’était pas le cas pour l’oxydase de type aa3 de la souche mutante. Cette oxydase est restée à une concentration constante lors de la phase post mi-logarithmique. Des essais de protection à la RNase ont aussi révélé l’expression dépendante de la phase de croissance tardive du messager de l’oxydase bd, et démontré que les sous-unités des gènes I et II étaient co-transcrites dans un opéron.

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