The reversible enolization and hydration of pyruvate: possible roles of keto, enol, and hydrated pyruvate in lactate dehydrogenase catalysis

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Abstract

The reversible enolization and hydration of pyruvic acid and pyruvate anion were monitored using spectrophotometric methods at several temperatures. Widely varying values for the equilibrium constant for the enolization of pyruvic acid and pyruvate ion appear in the literature. To accurately determine the position of equilibrium for the enolization reaction, we have developed a method that gives consistent results in which purified samples of sodium pyruvate are first “titrated” with triiodide ion to remove any triiodide-scavenging impurities such as those resulting from aldol condensation reactions. After reequilibration to allow the regeneration of enol pyruvate, the addition of small quantities of triiodide result in an initial burst in the decrease of absorbance at 353 nm, followed by the much slower zero-order decrease due to the formation of new enol pyvuvate molecules. The absorbance change during the burst phase of the reaction is proportional to the enol concentration plus that of any triiodide-scavenging impurity which may be present in the original pyruvate solution. Thus, as the quantity of triiodide used in the pretreatment stage of the experiments is increased, these burst absorbance changes, ΔA, decrease until a constant value of ΔA is reached. Accordingly, this final ΔA value is proportional to enol pyruvate (or enol pyruvic acid) in the absence of triiodide-scavenging impurity, allowing the accurate and reproducible determinations of Kenol. The equilibrium constants for both pyruvate and pyruvic acid are relatively temperature insensitive and, typically, Kenol (pyruvate anion) = 2.6 × 10−5 and Kenol (pyruvic acid) = 7.8 × 10−5 at 25.0°C. The zero-order phase of the reaction of triiodide ion may be used to calculate rate constants for enolization. The hydration and dehydration of pyruvic acid were followed directly by following absorbance changes in the peak at 340 nm due to the keto group. The thermodynamic and kinetic results reported in this paper are used to help determine whether the observed “substrate” inhibition of the lactate dehydrogenase catalyzed reduction of pyruvate is actually caused by keto, hydrated, or enol pyruvate.

Opérant à plusieurs températures et faisant appel à des méthodes spectrophotométriques, on a examiné l'énolisation réversible et l'hydratation de l'acide pyruvique et de l'anion pyruvate. Des valeurs très variables apparaissent dans la littérature pour la constante d'équilibre pour l'énolisation de l'acide pyruvique et de l'ion pyruvate. Dans le but de déterminer la position de l'équilibre pour la réaction d'énolisaton d'une façon précise, on a développé une méthode qui donne des résultats reproductibles; elle implique l'utilisation d'échantillons purifiés de pyruvate de sodium « prétitrés » avec l'ion triiodure pour enlever toutes les impuretés susceptibles de capter le triiodure, telles que celles résultant de réactions de condensation aldolique. Après une rééquilibration pour permettre une régénération de l'énol du pyruvate, l'addition de faibles quantités de triiodure provoque une diminution initiale rapide de l'absorbance à 353 nm, suivie d'une diminution beaucoup plus lente d'ordre zéro causée par la formation de nouvelles molécules d'énol du pyruvate. Le changement rapide d'absorbance dans la phase initiale de la réaction est proportionnel à la concentration d'énol plus celle de toute impureté susceptible de capter le triiodure qui peut encore être présente dans la solution originale de pyruvate. Donc, si l'on augmente la quantité de triiodure utilisée dans le stage de prétraitement des expériences, ces changements rapides d'absorbance, ΔA, diminuent jusqu'à l'atteinte d'une valeur de ΔA constante. Il en résulte que cette valeur finale de ΔA est proportionnelle à l'énol du pyruvate (ou à l'énol de l'acide pyruvique) en l'absence d'impureté susceptible de capter le triiodure et qu'elle permet d'obtenir des valeurs précises et reproductibles pour les déterminations de Kénol. Les constantes d'équilibre tant pour le pyruvate que pour l'acide pyruvique sont relativement peu sensibles à la température et les valeurs types de Kénol (anion pyruvate) = 2,6 × 10−5 et Kénol (acide pyruvique) = 7,8 × 10−5, à 25°C. On peut utiliser la phase d'ordre zéro de la réaction du triiodure pour calculer les constantes de vitesse d'énolisation. Les réactions d'hydratation et de déshydratation de l'acide pyruvique sont suivies directement par les changements d'absorbance dans le pic à 340 nm dû au groupe cétonique. Les résultats thermodynamiques rapportés dans ce travail ont été utilisés pour déterminer si l'inhibition de « substrat » observé lors de la réduction du pyruvate catalysée par la déshydrogénase du lactate est de fait cause par le groupe cétonique, son hydrate ou l'énol du pyruvate.

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