Targeted engineering of Cupriavidus necator chromosome for biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) from vegetable oil

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Abstract

Previous studies have demonstrated that heterologous expression of PHA synthase from Aeromonas caviae (PhaCAc), capable of accepting (R)-3-hydroxyacyl-CoA of C4–C7 as substrates, could confer the ability to PHA-negative mutant of Cupriavidus necator PHB-4 to synthesize poly((R)-3-hydroxybutyrate-co-(R)-3-hydroxyhexanoate) [P(3HB-co-3HHx)] from vegetable oils. The mutation point within pha operon in PHB-4 was determined to be a single nonsense mutation within the PHA synthase gene (phaCCn), suggesting the much lower β-ketothiolase and NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase activities observed in this strain would be a polar effect of the mutation. For further efficient biosynthesis of P(3HB-co-3HHx) copolyester, C. necator wild strain H16 was engineered by homologous recombination targeting the chromosomal phaCCn, and the PHA productivity was compared with previous PHB−4-derived strain harboring phaCAc on a multi-copy plasmid (PHB−4/pJRDEE32d13). A strain H16CAc, in which phaCCn was substituted for phaCAc on the chromosome, could produce P(3HB-co-3HHx) from soybean oil with high productivity, but the 3HHx fraction in the accumulated polymer was decreased. Meanwhile, H16ΔC/pJRDEE32d13, that lost region for the original synthase gene and expresses exochromosomal phaCAc, grew and accumulated PHA with similar properties to the PHB−4-derived strain. The results of enzyme assay suggested that low β-ketothiolase activity might be relevant for decrease of growth ability accompanied by increase of 3HHx composition when soybean oil was fed as a sole carbon source.

Des études antérieures ont démontré que l'expression hétérologue de la synthase de PHA de Aeromonas caviae (PhaCAc), qui est capable d'accepter comme substrat du (R)-hydroxyacyl-CoA comportant de quatre à sept atomes de carbone, peut conférer l'habilité au mutant PHA-négatif du Cupriavidus necator PHB−4 de synthétiser du poly ((R)-3-hydroxybutylate-co-(R)-3-hydroxyhexanonate) [P(3HB-co-3HHx)] à partir d'huies végétales. On a déterminé le point de mutation de l'opéron pha du PHB−4 en effectuant une seule mutation dans le gène de la synthase de PHA (phaCCn), ce qui suggère que les activités beaucoup plus faible de réductase de l'acétoacétyl-CoA dépendantes sur la β-cétothiolase et la NADPH résultent d'un effet polaire de la mutation. Afin d'améliorer la biosynthèse du copolyester [P(3HB-co-3HHx)], on a modifié la source sauvage H16 du C. necator par une recombinaison homologue orientée vers le (phaCCn) chromosomique et on a comparé la productivité en PHA avec celle obtenue antérieurement avec la souche dérivée du PHB−4 présentant un (phaCAc) sur un plasmide à plusieurs copies (PHB−4/pJRDEE32d13). Une souche de H16CAc dans laquelle on a substitué un phaCAc par un phaCCn sur le chromosome peut produire du P(3HB-co-3HHx) à partir de l'huile de soya avec une productivité élevée, mais la fraction de 3HHx dans le polymère accumulé est diminuée. Par ailleurs, le H16ΔC/pJRDEE32d13, cette région perdue du gène original de la synthase, et du phaCAc d'expressions exochromosomales ont permis de faire croître et d'accumulé du PHA ayant des propriétés similaires à celles du produit obtenu à partir de la souche dérivée du PHB−4. Les résultats des essais avec les enzymes suggèrent qu'une faible activité β-cétothiolase pourrait jouer un rôle important dans la diminution de la de l'habilité à faire croître qui accompagne l'augmentation de la composition 3HHx quand on utilise uniquement de l'huile de soya comme source de carbone. Mots-clés: polyhydroxyalcanoates, poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanonate), synthase de PHA, Cupriavidus necator, huile végétale. [Traduit par la Rédaction]

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