Ral-GTPase interacts with the β1 subunit of Na+/K+-ATPase and is activated upon inhibition of the Na+/K+ pump

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Abstract

Na+/K+-ATPase functions as both an ion pump and a signal transducer. Cardiac glycosides partially inhibit Na+/K+-ATPase, causing activation of multiple interrelated growth pathways via the Na+/K+-ATPase/c-Src/epidermal growth factor receptor complex. Such pathways include Ras/MEK/ERK and Ral/RalGDS cascades, which can lead to cardiac hypertrophy. In search of novel Ral-GTPase binding proteins, we used RalB as the bait to screen a human testes cDNA expression library using the yeast 2-hybrid system. The results demonstrated that 1 of the RalB interacting clones represented the C-terminal region of the β1 subunit of Na+/K+-ATPase. Further analysis using the yeast 2-hybrid system and full-length β1 subunit of Na+/K+-ATPase confirmed the interaction with RalA and RalB. In vitro binding and pull-down assays demonstrated that the β1 subunit of Na+/K+-ATPase interacts directly with RalA and RalB. Ral-GTP pull-down assays demonstrated that short-term ouabain treatment of A7r5 cells, a rat aorta smooth muscle cell line, caused activation of Ral GTPase. Maximal activation was observed 10 min after ouabain treatment. Ouabain-mediated Ral activation was inhibited upon the stimulation of Na+/K+-ATPase activity by Ang II. We propose that Ral GTPase is involved in the signal transducing function of Na+/K+-ATPase and provides a possible molecular mechanism connecting Ral to cardiac hypertrophy during diseased conditions.

La Na+/K+-ATPase agit à la fois comme une pompe ionique et un transducteur de signal. Les glycosides cardiaques inhibent partiellement la Na+/K+-ATPase, provoquant l'activation de multiples voies de croissance interreliées par l'intermédiaire du complexe Na+/K+-ATPase/c-Src/récepteur du facteur de croissance épidermique. Ces voies comprennent les cascades Ras/MEK/ERK et Ral/RalGDS, qui peuvent conduire à une hypertrophie cardiaque. Afin de trouver de nouvelles protéines de liaison à Ral-GTPase, nous avons utilisé RalB comme appât dans le système de levure à 2 hybrides pour cribler une librairie d'ADNc de testicules humains. Les résultats ont démontré que l'un des clones interagissant avec RalB représente la région C-terminale de la sous-unité β1 de la Na+/K+-ATPase. Une autre analyse au moyen du système de levure à 2 hybrides et de la sous-unité β1 pleine longueur de la Na+/K+-ATPase a confirmé l'interaction avec RalA et RalB. Des essais de liaison et de pull-down in vitro ont démontré que la sous-unité β1 de la Na+/K+-ATPase interagit directement avec RalA et RalB. Les essais de pull down GTP-Ral ont démontré qu'un bref traitement à l'ouabaïne des cellules A7r5, une lignée de cellules musculaires lisses de l'aorte de rat, a provoqué l'activation de la Ral GTPase, qui a été maximale 10 min après le traitement. La stimulation de la Na+/K+-ATPase par l'Ang II a inhibé l'activation de Ral induite par l'ouabaïne. Nous suggérons que la Ral ATPase joue un rôle dans la fonction de transduction des signaux de la Na+/K+-ATPase et qu'elle pourrait fournir un mécanisme moléculaire associant Ral à l'hypertrophie cardiaque dans les états pathologiques.

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