Role of hypoxia in the regulation of periovulatory EDN2 expression in the mouse

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Abstract

We have previously proposed endothelin-2 (EDN2) as a granulosa cell-derived contractile signal that facilitates ovulation. Spatially, Edn2 mRNA expression is restricted to granulosa cells of periovulatory follicles. Temporally, mRNA for this contractile peptide is expressed immediately before follicle rupture. The primary objective of this study was to test the hypothesis that hypoxia mediates EDN2 expression in granulosa cells at ovulation, and if it does, to determine the region within the promoter responsible for this effect. To determine the effect of hypoxia on mRNA expression, immature mice were treated with 5 IU of PMSG followed 48 h later by 5 IU of human chorionic gonadotropin (hCG). Granulosa cells were isolated at 9 h after hCG, cultured under normal or hypoxic conditions, and the expression level of mRNA was compared. mRNA expression was increased when granulosa cells were cultured in a hypoxic environment (p < 0.05). Subsequent promoter analysis found that the 5′ upstream region of the EDN2 promoter (between–1894 bp and–1407 bp) was responsible for hypoxia-mediated changes in EDN2 expression. This promoter region contains multiple sites for potential transcriptional regulation, including that by hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1, ACGTG) at–1297 bp. The second objective of this study was to determine whether the progesterone receptor (PR) or cyclooxygenase-2 (COX-2), two key regulators of periovulatory events, controlled EDN2 expression. To accomplish this, gonadotropin-primed mice were treated with RU-486 or indomethacin and expression of mRNA for Edn2 was determined in ovaries collected at 12 h after hCG. Treatment with RU-486 or indomethacin did not affect expression of mRNA for Edn2 (p > 0.05). Taken together, we believe that hypoxia, but not the PR or COX-2, regulate gonadotropin-induced EDN2 expression in the periovulatory follicle.

L'endothéline-1 (EDN2) a récemment été présentée comme un signal contractile dérivé des cellules de la granulosa facilitant l'ovulation. Spatialement, l'expression de l'ARNm de l'Edn2 est limitée aux cellules de la granulosa des follicules périovulatoires. Temporellement, l'ARNm de ce peptide contractile est exprimé juste avant la rupture du follicule. La présente étude a eu comme premier objectif de vérifier l'hypothèse que l'hypoxie médie l'expression de l'EDN2 dans les cellules de la granulosa au moment de l'ovulation, et, dans l'affirmative, de déterminer la région du promoteur à l'origine de cet effet. Pour déterminer l'effet de l'hypoxie sur l'expression de l'ARNm, des souris immatures ont été traitées avec 5 UI de PMSG puis, 48 h plus tard, avec 5 UI d'hCG. Les cellules de la granulosa ont été isolées 9 h après l'hCG, mises en culture dans des conditions normales et hypoxiques, et le niveau d'expression de l'ARNm dans les cellules a été comparé. L'expression de l'ARNm a augmenté lorsque les cellules de la granulosa ont été cultivées dans un environnement hypoxique (p < 0,05). Une analyse subséquente du promoteur a indiqué que la région en amont 5' du promoteur d'EDN2 (entre–1894 et–1407 pb) était à responsable des modifications de l'expression de l'EDN2 véhiculées par l'hypoxie. Cette région contient de nombreux sites pour une régulation transcriptionnelle potentielle, dont celle par le facteur-1 inductible par l'hypoxie (HIF-1; ACGTG) à–1297 pb. L'étude a eu comme deuxième objectif de déterminer si le récepteur de la progestérone (RP) ou la cyclooxygénase-1 (COX-2), deux régulateurs clés de événements périovulatoires, ont régulé l'expression de l'EDN2. Dans ce but, des souris sensibilisées à la gonadotrophine ont été traitées par RU-486 ou indométhacine, et l'expression de l'ARNm de l'Edn2 a été déterminée dans les ovaires prélevées 12 h après l'hCG. Le traitement par RU-486 ou indométhacine n'a pas influé sur l'expression de l'ARNm de l'Edn2 (p < 0,05). Ces résultats portent à croire que l'hypoxie, mais pas le RP ni COX-2, régule l'expression de l'EDN2 induite par la gonadotrophine dans le follicule périovulatoire.

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