In-situ-Topoproteom-Analyse kutaner Lymphome: Perspektiven der Unterstützung der dermatohistologischen Diagnostik mittels Multi-Epitop-Liganden-Cartographie (MELC)

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Abstract

Hintergrund

Die Immunphänotypisierung ist für die Diagnostik kutaner Lymphome wesentlich. Als eine diesbezüglich relevante innovative Weiterentwicklung der Multiplex-Fluoreszenz-Mikroskopie stellen wir eine Hautgewebe-adaptierte Anwendungsplattform der MELC-Technologie vor. Patienten und Methoden: Diese Topoproteom-Analyse erlaubt in situ die subzelluläre Kolokalisation von mindestens n = 100 Epitopen. Dabei wird das Präparat in einem Toponome Imaging Cycler® unter n-facher Wiederholung des folgenden Zyklus prozessiert: 1.) Färbung mit einem Fluorophor-markierten Antikörper, 2.) Fluoreszenz-Imaging und 3.) Photobleaching. Überlagerung und Bina-risierung der Fluoreszenz-Bilder führt zu Combinatorischen Molekularen Phänotypen (CMP), die einem Pixel bzw. einer mikrotopographischen Unit (450 ′ 450 nm2, 20x Objektiv) zugeordnet sind. Die Hautproben stammten von Patienten mit Mycosis fungoides (Patch/Plaque-Läsionen), Psoriasis, atopischem Ekzem sowie von Normalhautspendern.

Ergebnisse

In Orientierung an die WHO-EORTC-Klassifikation der kutanen Lymphome wurde eine MELC-Bibliothek für 23 Marker etabliert. Nach einem inau-gurativ im Detail beschriebenen Verfahren wurde die CMP-Frequenz bestimmt, und zwar in Normierung auf 100 um horizontale Hautgewebebreite. Mittels TopoMiner-Strategie ließ sich die Mycosis fungoides von den übrigen Zuständen mit maximaler Signifikanz (p ≤ 0, 03) durch die mindestens 10fache Überexpression des folgenden tumorzellrepräsentativen CMP-Motivs separieren: CD3+/CD4+/CD1a-/CD7-/CD8-/CD45R0+/CD45RA-/CD11a+. Schlussfolgerungen: Die Hautgewebe-adaptierte MELC-Anwendungsplattform erweitert die konventionelle Lymphomdiagnostik substanziell um eine bislang unerreichbare Dimension der In-situ-Analytik der Marker-Kombinatorik einschließlich ihrer exakten Quantifizierung und Visualisierung.

Background

Immunophenotyping is essential for diagnostics of cutaneous lymphomas. In this regard we present a skin tissue-adapted application platform of MELC technology.

Patients and Methods

This topoproteome analysis allows the subcellular colo-calization of at least n = 100 epitopes in situ. For this purpose the specimen is processed by a Toponome Imaging Cycler® for a n-fold repetition of the following cycle: 1) staining with a fluorophore-labeld antibody, 2) fluorescence-imaging, and 3) photobleaching. Overlay and binarization of fluorescence images lead to combinatorial molecular phenotypes (CMP), which relate to a pixel or microtopographic unit (450 ′ 450 nm2, 20x objective). Skin biopsies were derived from patients with mycosis fungoides (patch/plaque lesions), psoriasis, atopic eczema and from healthy skin donors.

Results

In orientation to the WHO-EORTC-classification of cutaneous lymphomas a MELC-library of 23 markers was established. According to an inaugu-rative detailed procedure the CMP frequency was determined in a normalization to 100 μrn horizontal skin width. By a TopoMiner strategy mycosis fungoides could be separated from the other states with a maximum of significance (p ≤ 0.03) by at least 10-fold overexpression of the following tumor cell-representative CMP-motif: CD3+/CD4+/CD1 a-/CD7-/CD8-/CD45R0+/CD45RA-/CD11a+.

Conclusions

The skin tissue-adapted MELC-application-platform extends substantially conventional lymphoma diagnostics by an unprecedented dimension of in-situ-analysis of marker combinatorics including its exact quantification and visualization.

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