DNA damage by gliotoxin from Aspergillus fumigatus. An occupational and environmental propagule: adduct detection as measured by 32P DNA radiolabelling and two-dimensional thin-layer chromatography

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Abstract

Summary.

Gliotoxin is produced by the fungus Aspergillus fumigatus. Aspergillus is widespread in the environment and this ubiquitous nature results in disease and co-carcinogenesis to be distributed world-wide. Gliotoxin contains an epipolythiodioxopiperazine (ETP) ring that is believed to be involved in redox reactions. The reactive oxygen species produced interact with DNA to form hydroxylated and other altered DNA products. To measure DNA adduct formation, we used 32P radiolabelling and, after enzymatic DNA digestion, separated adducts in two dimensions using thin-layer chromatography (2D-TLC), with ultimate autoradiography and densitometry. HeLa DNA was incubated with 0.1 mmol l−1 and 0.3 mmol l−1 of gliotoxin (and necessary redox agents) for 1 and 20 h. We found an increase in 6-hydro-5,6-dihydroxythymidine (thymine glycol) monophosphate [d(TG)MP] from 0.0% to 30.4%, an increase in 8-hydroxy-2′-deoxyguanidine monophosphate [8(OH)dGMP] from 0.0% to 4.2%, an increase in deoxynucleotide diphosphate (dNDP) from zero adducts to six DNA adducts, as well as an increase of other as yet unidentified adducts. Also, time exposure may have a greater effect than concentration based on a 20-h incubation with 0.3 mmol l−1 gliotoxin that completely obliterates the pyrimidines deoxythymidine 3′-monophosphate (dTMP) and deoxycytidine 3′-monophosphate (dGMP).

Gliotoxin wird von dem Pilz Aspergillus fumigatus produziert. Aspergillus ist weit in der Umwelt verbreitet, und diese ubiquitäre Natur ist für das weltweite Auftreten von Erkrankungen und Kokarzinogenese verantwortlich. Gliotoxin enthält einen Epipolythiodioxopiperazin (ETP)-Ring, der vermutlich an Redoxreaktionen beteiligt ist. Die reaktiven Oxygenderivate, die dadurch entstehen, treten mit DNA in Wechselwirkung, was zu hydroxylierten oder anderweitig modifizierten DNS-Produkten führt. Um DNA-Adduktbildung zu messen, benutzten wir 32P-Markierung und trennten nach enzymatischer DNA-Verdauung die Addukte durch zweidimensionale Dünnschicht-Chromatographie (2D-TLC) auf mit anschliessender Analyse durch Autoradiographie und Densitrometrie. DNA von HeLa-Zellen wurde mit 0.1 mmol l−1 beziehungsweise 0.3 mmol l−1 Gliotoxin fuer eine, bzw. 20 Stunden inkubiert (mit Zusatz von notwendigen Redoxsubstanzen). Wir beobachteten einen Anstieg des 6-Hydro-5,6-Dihydroxythymidin-(Thyminglycol) monophosphats [d(TG)MP] von 0.0% auf 30.4%, und des 8-Hydroxyl-2-Deoxyguanidinmonophosphats[8(OH)dGMP] von 0.0% aud 4.2%, des Desoxynukleotiddiphosphats [dNDP] von 0 auf 6 DNS-Addukten, und von anderen, bisher nicht identifizierten Addukten. Die Inkubationsdauer scheint einen größeren Effekt zu haben als die Konzentration der Reaktionspartner, weil die 20 Stunden dauernde Inkubation mit 0.3 mmol l−1 Gliotoxin die Pyrimidinnukleotide, Desoxythymidin-3′-monophosphat [dTMP] und Desoxycytidin-3′-monophosphat [dCMP] völlig entfernt hat.

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