Identification of medically important fungi by the Pyrosequencing™ technologyIdentifizierung medizinisch wichtiger Pilze mittels Pyrosequencing™-Technik


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Abstract

SummaryThe Pyrosequencing™ technology was used for identification of different clinically relevant fungi. The tests were performed on amplicons derived from the 18S rRNA gene using polymerase chain reaction (PCR) universal primers for amplification. Sequencing was performed up to 40 bases in a variable region with a designed general sequencing primer and the Pyrosequence data were analyzed by BLAST sequence search in the GenBank database. DNA from a total of 21 fungal specimens consisting of nine strains of clinically relevant fungi and 12 clinical specimens from patients suffering from proven invasive fungal infections were PCR-amplified and analyzed by gel electrophoresis, PCR-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the Pyrosequencing technology. All data obtained by the Pyrosequencing technology were in agreement with the results obtained by PCR-ELISA using species/genus-specific oligonucleotides and were as well in accordance with the culture results. The results demonstrate that the Pyrosequencing method is a reproducible and reliable technique for identification of fungal pathogens.ZusammenfassungDie Pyrosequenzierungs-Technik (Pyrosequencing™) wurde auf die Brauchbarkeit zur Identifizierung verschiedener klinisch relevanter Pilze eingesetzt. Die Tests wurden an Amplikons durchgeführt, die mittels PCR-Universalprimer durch Amplifikation vom 18S rRNA-Gen gewonnen wurden. Die Sequenzierung wurde durchgeführt in einer variablen Region über einen Abschnitt von bis zu 40 Basen mit einem allgemeinen Sequenzierungs-Primer; die Pyrosequenzierungs-Daten wurden analysiert mittels BLAST Sequenzsuche in der GenBank. DNA von insgesamt 21 Pilzstämmen (9 klinisch relevante Stämme und 12 klinische Isolate von Patienten mit bewiesenen Pilzinfektionen) wurden PCR-amplifiziert und mittels Gelelektrophorese, PCR-ELISA und der Pyrosequenztechnik analysiert. Alle Ergebnisse der Pyrosequenzierung stimmten mit den Ergebnissen des PCR-ELISA überein, bei dem art-/gattungsspezifische Oligonukleotide verwendet wurden, und standen im Einklang mit Kulturresultaten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Pyrosequenzierungsmethode eine reproduzierbare und verlässliche Technik zur Identifizierung pilzlicher Krankheitserreger darstellt.

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