Investigation of antimalarial activity, cytotoxicity and action mechanism of piperazine derivatives of betulinic acid

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Abstract

Objectives

To semisynthesise piperazine derivatives of betulinic acid to evaluate antimalarial activity, cytotoxicity and action mechanism.

Methods

The new derivatives were evaluated against the CQ-sensitive Plasmodium falciparum 3D7 strain by flow cytometry (FC) using YOYO-1 as stain. Cytotoxicity of 4a and 4b was performed with HEK293T cells for 24 and 48 h by MTT assay. The capability of compound 4a to modulate Ca2+ in the trophozoite stage was investigated. The trophozoites were stained with Fluo4-AM and analysed by spectrofluorimetry. Effect on mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was tested for 4a by FC with DiOC6 (3) as stain. For β-haematin assay, 4a was incubated for 24 h with reagents such as haemin, and the fluorescence was measured by FlexStation at an absorbance of 405 nm.

Results

Antimalarial activity of 4a and 4b was IC50 = 1 and 4 μm, respectively. Compound 4a displayed cytotoxicity with IC50 = 69 and 29 μm for 24 and 48 h, respectively, and 4b was not cytotoxic at the tested concentrations. Addition of 4a leads to an increase in cytosolic Ca2+. We have measured ΔΨm after treating parasites with the compound. Data on Figure 4a show that mitochondria were not affected. The action mechanism for 4a, inhibition of β-haematin formation (17%), was lower than CQ treatment (83%; IC50 = 3 mm).

Conclusion

Compound 4a showed excellent antimalarial activity, and its action mechanism is involved in Ca2+ pathway(s).

Objectifs

Semi-synthétiser des dérivés pipérazine de l'acide bétulinique et évaluer leur activité antipaludique, leur cytotoxicité et leur mécanisme d'action.

Méthodes

Les nouveaux dérivés ont été évalués sur la souche 3D7 de Plasmodium falciparum CQ-sensible par cytométrie de flux (CF) en utilisant YOYO-1 comme colorant. La cytotoxicité des dérivés 4a et 4b a été mesurée sur des cellules HEK293T pendant 24 et 48 heures à l'aide d'un test MTT. La capacité du dérivé 4a à moduler le Ca2+ chez le stade trophozoïte a été étudiée. Les tropozoïtes ont été colorés avec du Fluo4-AM et analysés par spectrofluorimétrie. L'effet sur le potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) a été testé pour 4a par CF avec DiOC6(3) comme colorant. Pour le test de la β-hématine, 4a a été incubé pendant 24 heures avec des réactifs tels que l'hémine et la fluorescence a été mesurée par FlexStation à une absorbance de 405 nm.

Résultats

L'activité antipaludique de 4a et 4b correspondait à IC50 = 1 et 4 μM, respectivement. Le dérivé 4a affichait une cytotoxicité correspondant à IC50 = 69 et 29 μM à 24 et 48 heures, respectivement, et 4b n’était pas cytotoxique aux concentrations testées. L'addition de 4a conduit à une augmentation du Ca2+ cytosolique. Nous avons mesuré ΔΨm après traitement des parasites avec le dérivé. Les données de la figure de 4a montrent que les mitochondries ne sont pas affectées. Le mécanisme d'action de 4a, inhibition de la formation de β-hématine (17%), était inférieure à celui du traitement au CQ (83%; IC50 = 3 mM).

Conclusion

Le dérivé 4a a montré une excellente activité antipaludique et son mécanisme d'action est impliqué dans les voies métaboliques du Ca2+.

Objetivos

Semi-sintetizar derivados de la piperazina y del ácido betulínico para evaluar su actividad antimalárica, citotoxicidad y mecanismo de acción.

Métodos

Los nuevos derivados se evaluaron frente a la cepa 3D7 de Plasmodium falciparum mediante citometría de flujo (CF) utilizando YOYO-1 como tinción. La citotoxicidad de 4a y 4b se realizó con células HEK293T en 24 y 48 horas mediante la prueba con metiltiazoltetrazolio (MTT). Se investigó la capacidad del compuesto 4a para modular Ca2+ en el trofozoito. Los trofozoítos se tiñeron con Fluo4-AM y se analizaron mediante espectrofluorometría. El efecto sobre el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) se evaluó para 4a mediante CF con tinción de DiOC6(3). Para el ensayo de β-hematina se incubó, durante 24 horas, el 4a con hemina y se midió la fluorescencia en una FlexStation a una absorbancia de 405 nm.

Resultados

La actividad antimalárica de 4a y 4b eran IC50 = 1 y 4 μM, respectivamente. El compuesto 4a mostraba citotoxicidad con IC50 = 69 y 29 μM a las 24 y 48 horas, respectivamente, y 4b no era citotóxico en las concentraciones evaluadas. Añadir 4a conlleva a un aumento del Ca2+ citosólico. Hemos medido ΔΨm después de tratar los parásitos con el compuesto. Los datos en la figura 4a muestran que la mitocondria no se vio afectada. El mecanismo de acción de 4a, inhibición de la formación de β-hematina (17%), era menor que para el tratamiento con cloroquina (83%; IC50 = 3 mM).

Conclusión

El compuesto 4a mostró una excelente actividad antimalárica y su mecanismo de acción está involucrado en la vía metabólica del Ca2+.

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