RecombinantCulicoides obsoletuscomplex allergens stimulate antigen-specific T cells of insect bite hypersensitive Shetland poniesin vitro

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Abstract

Background

Ponies may suffer from Insect bite hypersensitivity (IBH), an allergic IgE-mediated pruritic skin disorder, induced by allergens from biting midges of the Culicoides spp.

Hypothesis/Objectives

To determine whether recombinant Culicoides obsoletus allergens are able to activate T cells of ponies exposed to C. obsoletus and whether these allergen-specific responses differ between IBH-affected and healthy ponies.

Animals

Ten IBH-affected Shetland ponies and 10 age-matched healthy controls taken from the same stables, to ensure similar exposure to midges.

Method

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured with two different pools of recombinant C. obsoletus complex allergens to expand the allergen-specific T cells. These PBMC cultures were subsequently co-cultured with mature dendritic cells (DCs) loaded with the same antigens. Induction of Th1, Th2 and regulatory T (Treg) cells in these DC/PBMC co-cultures was assessed by analysis of IFN-γ, IL-4, IL-10 and FoxP3 expression levels using quantitative RT-PCR and phenotyping by flow cytometry.

Results

Recombinant C. obsoletus allergens increased IFN-γ mRNA expression levels, percentages of IFN-γ expressing (Th1) cells and CD25highFoxP3+IL-10+ Tregs compared to unstimulated DC/PBMC co-cultures. Stimulation of IL-4 expressing Th2 cells by the recombinant allergens was far less pronounced. The DC/PBMC co-cultures did not reveal significant differences between healthy and IBH-affected ponies for any of the analysed parameters, except for higher IL-4 mRNA levels in IBH affected ponies after stimulation with one of the two allergen pools.

Conclusion and clinical importance

The recombinant C. obsoletus complex allergens can stimulate antigen-specific Th1 and IL10 producing Treg cells and are therefore promising candidates for the immunotherapy of IBH.

Contexte

Les poneys peuvent être atteint d'hypersensibilité aux piqures d'insectes (IBH), une dermatose prurigineuse allergique médiée par les IgE, induite par les allergènes de morsures de Culicoides spp.

Hypothèses/Objectifs

Déterminer si les allergènes recombinant de Culicoides obsoletus peuvent activer les cellules T de poneys exposés à C. obsoletus et si ces réponses spécifiques d'allergènes diffèrent entre les poneys atteints d'IBH et les poneys sains.

Sujets

Dix poneys Shetland atteint d'IBH et 10 témoins sains du même âge et de la même écurie, assurant une exposition similaire aux moucherons.

Méthode

Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été mises en culture avec deux différents lots d'allergènes recombinants de C. obsoletus complex pour développer les cellules T spécifiques d'allergène. Ces cultures de PBMC ont été ensuite co-cultivées avec des cellules dendritiques matures (DCs) pourvues des mêmes antigènes. L'induction de Th1, Th2 et T régulatrices (Treg) dans ces co-cultures de DC/PBMC était évaluée par l'analyse des niveaux d'expression de IFN-c, IL-4, IL-10 et FoxP3 par RT-PCR quantitative et le phénotypage par cytométrie de flux.

Résultats

Les allergènes recombinant de C. obsoletus augmentaient l'expression d'ARNm d'IFN-c, les pourcentages de cellules (Th1) exprimant IFN-c et Tregs CD25highFoxP3+IL-10+ comparé aux co-cultures DC/PBMC non-stimulées. La stimulation des cellules Th2 exprimant IL-4 par les allergènes recombinant était nettement moins prononcée. Les co-cultures DC/PBMC ne révélaient pas de différence significatives entre les poneys sains et les poneys atteint d'IBH pour aucun des paramètres analysés à l'exception de niveaux d'ARNm d'IL-4 plus élevés chez les poneys atteints d'IBH après stimulation avec l'un des deux pools d'allergènes.

Conclusion et importance clinique

Les allergènes recombinant de C. obsoletus complex peuvent stimuler les Th1spécifiques d'antigène et les cellules Treg produisant IL10 et sont ainsi des candidats prometteurs pour l'immunothérapie de l'IBH.

Introducción

los ponies pueden sufrir hipersensibilidad por picadura de insecto (IBH), una enfermedad pruriginosa alérgica de la piel mediada por IgE de inducida por alergenos de los insectos picadores del género Culicoides.

Hipótesis/Objetivos

determinar si alergenos recombinante C. obsoletus son capaces de activar los linfocitos T de ponies expuestas a C. obsoletus, y si estas respuestas específicas de alergeno difieren entre ponies afectados y ponies sanos.

Animales

10 ponies de raza Shetland afectados con IBH, y 10 controles sanos con edades similares tomados de los mismos establos, para asegurar una exposición similar a los insectos.

Métodos

se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con dos diferentes cócteles de alergenos recombinantes C. obsoletus para expandir los linfocitos T específicos de alergenos. Estos cultivos de PBMC fueron después co-cultivados con células dendríticas maduras (DC) cargadas con el mismo tipo de antígenos. Se evaluó la inducción de Th1, Th2, y linfocitos T reguladores (Treg) en los co-cultivos DC/PBMC analizando los niveles de expresión de IFN-c, IL-4, IL-10, FoxP3 mediante RT-PCR cuantitativa y fenotipado mediante citometría de flujo

Resultados

los alergenos recombinantes de C. obsoletus incrementaron la expresión de mRNA de IFN-los porcentajes de linfocitos T expresando IFN-c, y los linfocitos Treg positivos con a CD25, con expresión alta de FoxP3, y positivos IL-10 comparados con co-cultivos DC/PBMC no estimulados. La estimulación de linfocitos Th2 expresando IL-4 por los alergenos recombinantes fue mucho menos pronunciada. Los co-cultivos de DC/PBMC no revelaron diferencias significativas entre animales sanos y animales afectados por IBH en ninguno de los parámetros realizados, a excepción de mayores niveles de mRNA de IL-4 en los ponies afectados por IBH tras la estimulación con uno de los dos cócteles de antígeno.

Conclusiones e importancia clínica

el complejo de alergenos recombinante de C. obsoletus puede estimular los linfocitos Th1 específicos de antígeno y linfocitos Treg productores de IL-10 y son por tanto candidatos prometedores para la inmunoterapia de IBH.

Hintergrund

Ponys können an einer Insektenstichhypersenisibilität (IBH), einer allergischen IgE-vermittelten juckenden Hauterkrankung leiden, die von Allergenen der beißenden Mücken der Culicoides spp. verursacht wird.

Hypothese/Ziele

zu bestimmen, ob rekombinante Culicoides obsoletus Allergene imstande sind T Zellen von Ponys, die C. obsoletus ausgesetzt sind, zu aktivieren und herauszufinden, ob diese Allergen-spezifischen Antworten sich zwischen den IBH-betroffenen und gesunden Ponies unterscheiden.

Tiere

Es wurden zehn IBH-betroffene Shetland Ponies und 10 altersangepasste gesunde Kontrollponies aus denselben Stallungen verwendet, um eine ähnliche Exposition zu Mücken zu gewährleisten.

Methoden

Es wurden periphere mononukleäre Blut-Zellen (PBMC) mit zwei unterschiedlichen Pools an rekombinanten C. obsoletus Komplexallergenen kultiviert, um die Allergen-spezifischen T Zellen zu expandieren. Diese PBMC Kulturen wurden in der Folge gleichzeitig mit reifen dendritischen Zellen (DCs) kultiviert, die mit denselben Allergenen beladen waren. Eine Induktion der Th1, Th2 und regulatorischen T (Treg) Zellen in diesen DC/PBMC Co-Kulturen wurde mittels Analyse der Exprimierungslevels von IFN-c, IL-4, IL-10 und FoxP3 mittels quantitativer RT-PCR und Phänotypisierung mittels Flowzytometrie beurteilt.

Ergebnisse

Rekombinante C. obsoletus Allergene erhöhten die mRNA Exprimierungslevels von IFN-c, sowie prozentual die IFN-c exprimierenden (Th1) Zellen und CD25highFoxP3+IL-10+tregs im Vergleich zu unstimulierten DC/PBMC Co-Kulturen. Die Stimulierung von IL-4 exprimierenden Th2 Zellen durch rekombinante Allergene war wesentlich weniger betont. Die DC/PBMC Co-Kulturen zeigten für keine der analysierten Parameter, außer für hohe IL-4 mRNA Werte bei IBH betroffenen Ponys nach der Stimulierung mit einem der beiden Allergenpools signifikante Unterschiede zwischen gesunden und IBH-betroffenen Ponys.

Schlussfolgerungen und klinische Bedeutung

Die rekombinanten C. obsoletus Komplexallergene können Antigen-spezifische Th1 und IL-10 produzierende Treg Zellen stimulieren und sind daher vielversprechende Kandidaten für eine Immuntherapie bei IBH.

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